啟因生物位于上海，成立于2013年，專業(yè)在微生物研究領(lǐng)域提供qPCR技術(shù)服務(wù)和相關(guān)絕對定量PCR試劑盒。
目前已經(jīng)合作過上百家科研單位，包括哈工大環(huán)境學(xué)院，清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，中科院土壤所，上海交大環(huán)境學(xué)院，同濟大學(xué)環(huán)境學(xué)院等，協(xié)助發(fā)表的文章雜志包括EST,JHM,BT,EP等頂級環(huán)境領(lǐng)域?qū)W術(shù)雜志，方法署名文章已經(jīng)超過上百篇。
相對定量：
檢測目的基因在樣本中的相對比例，通過2-??ct計算。
絕對定量：
檢測目的基因在樣本中的分子量，即通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線對目的基因進行分子數(shù)目的定量。
①高通量抗性基因qPCR檢測
| Gene Classification | gene |
|---|---|
| Aminoglycoside |
AAC;AAC(6')I1;AAC(6')-IB-1;AAC(6')-IB-2;AAC(6')-IB-3;AAC(6')-II;AAC(6')-IY; AACA/APHD;AACC;AACC1;AACC2;AACC4;AADA-01;AADA-02;AADA1;AADA-1-01; AADA-1-02;AADA2-01;AADA2-02;AADA2-03;AADA5-01;AADA5-02;AADA9-01;AADA9-02; AADD;AADE;APH;APH(2')-ID-01;APH(2')-ID-02;APH6IA;APHA1;APHA3-01;APHA3-02;SPCN-01;SPCN-02;STR;STRA;STRB |
| Beta Lactamase |
AMPC/BLADHA;AMPC-01;AMPC-02;AMPC-03;AMPC-04;AMPC-05;AMPC-06; AMPC-07;AMPC-08;AMPC-09;BLA1;BLA-ACC-1;BLACMY;BLACMY2-01;BLACMY2-02; BLACTX-M-01;BLACTX-M-02;BLACTX-M-03;BLACTX-M-04;BLACTX-M-05;BLACTX-M-06; BLAGES;BLAIMP-01;BLAIMP-02;BLA-L1;BLAMOX/BLACMY;BLAOCH;BLAOKP;BLAOXA1/BLAOXA30; BLAOXA10-01;BLAOXA10-02;BLAOXY;BLAPAO;BLAPER;BLAPSE;BLAROB;BLASFO;BLASHV-01; BLASHV-02;BLATEM;BLATLA;BLAVEB;BLAVIM;BLAZ;CEPA;CFIA;CFXA;CPHA-01;CPHA-02;FOX5;MECA;NDM1;PBP;PBP2X;PBP5;PENA} |
| FCA |
ACRA-01;ACRA-02;ACRA-03;ACRA-04;ACRA-05;ACRB-01;ACRB-02;ACRF;ADEA;CATA1; CATB3;CFR;CMEA;CMLA1-01;CMLA1-02;CMX(A);EMRB/QACA;FLOR;MEXA;MEXD;MEXE;MEXF; OPRJ;PMRA;QNRA;YIDY/MDTL-01;YIDY/MDTL-02 |
| MGEs |
INTI1;TNPA-01;TNPA-02;TNPA-03;TNPA-04;TNPA-05;TNPA-07 |
| MLSB |
CARB;EREA;ERM(34);ERM(35);ERM(36);ERMA;ERMA/ERMTR;ERMB; ERMC;ERMF;ERMJ/ERMD;ERMK-01;ERMK-02;ERMT-01;ERMT-02;ERMX;ERMY; LMRA-01;LMRA-02;LNUA-01;LNUA-02;LNUB-01;LNUB-02;LNUC;MATA/MEL;MDTA; MEFA;MPHA-01;MPHA-02;MPHB;MPHC;MSRA-01;MSRA-02;MSRC-01;MSRC-02; OLEC;PIKR1;PIKR2;VATB-01;VATB-02;VATC-01;VATC-02;VATD;VATE-01;VATE-02; VGAA-01;VGAA-02;VGAB-01;VGAB-02;VGB-01;VGB-02;VGBB-01;VGBB-02 |
| other/efflux |
CATB8;DFRA1;DFRA12;EREB;FOLA |
| Sulfonamide |
SUL1;SUL2;SULA/FOLP-01;SULA/FOLP-02;SULA/FOLP-03 |
| Tetracycline |
TET(32);TET(34);TET(35);TET(36)-01;TET(36)-02;TET(37);TET(38);TETA-01;TETA-02; TETB-01;TETB-02;TETC-01;TETC-02;TETD-01;TETD-02;TETE;TETG-01;TETG-02;TETH; TETJ;TETK;TETL-01;TETL-02;TETM-01;TETM-02;TETO-01;TETO-02;TETPA;TETPB-01; TETPB-02;TETPB-03;TETPB-04;TETPB-05;TETQ;TETR-01;TETR-02;TETR-03;TETS;TETT;TETU-01;TETU-02;TETV;TETW-01;TETX |
| Vancomycin |
VANA;VANB-01;VANB-02;VANC-01;VANC-02;VANC-03;VANC1;VANC2/VANC3; VAND;VANG;VANHB;VANHD;VANRA-01;VANRA-02;VANRB;VANRC;VANRC4;VANRD;VANSA; VANSB;VANSC-01;VANSC-02;VANSE;VANTC-01;VANTC-02;VANTE;VANTG;VANWB;VANWG; VANXA;VANXB;VANXD;VANYB;VANYD-01;VANYD-02 |
②常規(guī)抗性基因qPCR檢測
只需提供樣品，告知檢測的抗性基因名稱即可。
| 中文名稱 | 英文名稱 |
|---|---|
| 腸桿菌科 |
Enterobacteriaceae |
| 腸球菌屬 |
Enterococcus |
| 大腸桿菌屬 |
Escherichia |
| 放線菌門 |
Actinobacteria |
| 古菌 |
Archaea |
| 假單胞菌屬 |
Pseudomonas |
| 金黃色葡萄球菌 |
Staphylococcus aureus |
| 鏈球菌屬 |
Streptococcus? |
| 釀酒酵母 |
Saccharomyces cerevisiae? |
| 乳酸桿菌屬 | Lactobacillus |
| 鼠李糖乳桿菌 | Lactobacillus rhamnosus |
| 雙歧桿菌屬 | Bifidobacterium |
| 梭菌屬 | Clostridium |
| 細(xì)菌 | Bacteria |
| 芽孢桿菌 | Bacillus velezensis |
| 真菌 | Fungi |
微生物在氮循環(huán)中固氮作用（nitrogen fixation）、同化作用（Assimilation）、氨化作用（ammonification）、硝化作用（nitrification）、反硝化作用（denitrification）、厭氧氨氧化作用(anammox)等一系列過程。
| 參與途徑 | gene |
| 硝化作用 | amoA;amoB;amoC |
| 固氮 | anfH;anfG;anfD;anfK;hzsA;hzsB;hzsC;nifD;nifH;nifK |
| 反硝化作用 | norZ;nosZ |
微生物在碳循環(huán)中的作用，一是通過光合作用和化能合成作用來固定CO2，一些光能自養(yǎng)微生物，如藻類、光合細(xì)菌等通過光合作用直接利用自然界中的CO2合成有機碳化物，進而轉(zhuǎn)化成各種有機物；化能自養(yǎng)菌能利用化學(xué)能同化CO2。二是通過分解作用產(chǎn)生CO2，在自然界參與有機物分解的主要是細(xì)菌，真菌和放線菌等。
| 參與途徑 | gene |
| 固碳途徑 | cbbL ;cbbM;porA/nifJ;oorA;aclB;acsA ;acsB;accA;hcd |
| 甲烷代謝 | mcrA;pmoA;mmoX |
| 碳降解 | amyA;amyX;xylA;ChiA;ChiB;ChiC |
微生在硫循環(huán)中同行硫酸鹽還原，脫硫作用，硫化作用，反硫化作用，及異化性硫還原作用等
| 參與途徑 | gene |
| 硫相關(guān) | dsrA;dsrB;soxB |
| 砷相關(guān) | aioA;arrA;arsC;arsM |
微生物在磷循環(huán)中磷活化，磷吸收等過程
| 參與途徑 | gene |
| 磷養(yǎng)分活化 | phoA;phoB;phoD;phoN |
| 磷吸收 | phnC;phnD;phnE;phnK;phnV |
| 磷缺乏響應(yīng)調(diào)控 | phoB;phoR;phoP;phoU |
二、檢測樣本類型及送樣要求?
①樣本類型
菌液，菌絲體，土壤，糞便，腸道內(nèi)容物，食糜，水樣（濾膜），空氣樣本等。
②送樣要求
| 樣本類型 | 樣本量 |
| 菌液 | ≥5ml |
| 菌絲體 | ≥0.5g |
| 土壤 | ≥0.5g |
| 糞便 | ≥0.5g |
| 腸道內(nèi)容物 | ≥0.5g |
| 食糜 | ≥0.5g |
| 水體 |
過濾（直徑3-4cm濾膜2-3張） 或者12000rpm 離心，進行富集。 |
| 空氣 | 用無菌濾膜過濾空氣 |
注：送樣時使用干冰寄樣，保證低溫運輸。
三、檢測方法??
熒光染料(SYBR Green)
一種結(jié)合于雙鏈DNA的雙螺旋小溝區(qū)域的綠色熒光染料。
在游離狀態(tài)下，SYBR Green 發(fā)出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。
四、qPCR實驗流程??
五、結(jié)果分析??
1.抗性基因絕對定量PCR
擴增曲線&熔解曲線
擴增曲線（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒）
熔解曲線（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒）
標(biāo)準(zhǔn)曲線計算（示例）
| 不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)物 | log10(拷貝數(shù)/每微升) | CT值 |
| 原液(1號) | 6 | 8.135 |
| 10-1(2號) | 5 | 11.656 |
| 10-2(3號) | 4 | 14.977 |
| 10-3(4號) | 3 | 18.398 |
| 10-4(5號) | 2 | 21.625 |
| 10-5(6號) | 1 | 24.942 |
例如：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.3533x+28.359（X是拷貝數(shù)對數(shù)值，Y值CT值）
| 樣品名稱 | CT值（Y） | X值 | 拷貝數(shù)（10^x值） |
| 1 | 20 | 2.492768 | 311.0057 |
| 2 | 25 | 1.0017 | 10.03922 |
| 3 | 30 | -0.48937 | 0.324064 |
目的基因ct為20：提取樣本的稱重數(shù)據(jù)為0.25g，溶解DNA體積為50μl，上機檢測時樣本的稀釋倍數(shù)為5倍。
目的基因拷貝數(shù)每克：311.0057*50（DNA體積）/0.25（稱重數(shù)據(jù)）*5（稀釋倍數(shù)）=311005.7
2.高通量抗性基因分析作圖
ARGs檢出數(shù)
| ARGs檢出統(tǒng)計表 | |||||||||
| 樣品名稱 | Amino | FCA | Beta | MLSB | others | MGEs | Sul | Tet | Van |
| A | 25 | 8 | 15 | 13 | 4 | 7 | 4 | 14 | 9 |
| B | 21 | 6 | 14 | 15 | 5 | 5 | 4 | 16 | 5 |
| C | 21 | 5 | 10 | 18 | 3 | 4 | 4 | 20 | 7 |
| D | 23 | 7 | 8 | 15 | 3 | 6 | 4 | 18 | 11 |
| E | 22 | 2 | 6 | 20 | 2 | 4 | 4 | 17 | 8 |
Circos圖
微生物與環(huán)境因子分析
RDA分析：
六、客戶文獻?
| 文章信息 | 一作單位 | 發(fā)表雜志 | IF |
| Wang Q, Zhang Z, Xu G, et al. Pyrolysis of penicillin fermentation residue and sludge to produce biochar: Antibiotic resistance genes destruction and biochar application in the adsorption of penicillin in water[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 413: 125385. | 哈爾濱工業(yè)大學(xué) | J Hazard Mater | 10.588 |
| 城市水資源與環(huán)境國家重點實驗室 | |||
| Wang M, Ren P, Liu H, et al. Investigating antibiotics, antibiotic resistance genes in soil, groundwater and vegetables in relation to agricultural field-Applicated with lincomycin mycelial residues compost[J]. Science of The Total Environment, 2021, 777: 146066. | 青島科技大學(xué) | Sci Total Environ | 7.963 |
| 環(huán)境與安全工程學(xué)院 | |||
| Zhou H, Cao Z, Zhang M, et al. Zero-valent iron enhanced in-situ advanced anaerobic digestion for the removal of antibiotics and antibiotic resistance genes in sewage sludge[J]. Science of The Total Environment, 2021, 754: 142077. | 上?？萍即髮W(xué) | Sci Total Environ | 7.963 |
| 環(huán)境與建筑學(xué)院 | |||
| Yue Z, Zhang J, Zhou Z, et al. Pollution characteristics of livestock faeces and the key driver of the spread of antibiotic resistance genes[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 409: 124957. | 中國科學(xué)院南京土壤研究所 | J Hazard Mater | 10.588 |
| 土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室 | |||
| Cheng D, Liu Y, Shehata E, et al. In-feed antibiotic use changed the behaviors of oxytetracycline, sulfamerazine, and ciprofloxacin and related antibiotic resistance genes during swine manure composting[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 402: 123710. | 東莞理工大學(xué) | J Hazard Mater | 10.588 |
| 生態(tài)環(huán)境工程研究中心 | |||
| Ni B J, Yan X, Dai X, et al. Ferrate effectively removes antibiotic resistance genes from wastewater through combined effect of microbial DNA damage and coagulation[J]. Water research, 2020, 185: 116273. | 同濟大學(xué) | Water research | 11.236 |
| 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 | |||
| 污染控制與資源化利用國重實驗室 | |||
| Liu Y, Cheng D, Xue J, et al. Changes in microbial community structure during pig manure composting and its relationship to the fate of antibiotics and antibiotic resistance genes[J]. Journal of hazardous materials, 2020, 389: 122082. | 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 | J Hazard Mater | 10.588 |
| 農(nóng)業(yè)資源與區(qū)域規(guī)劃研究所 | |||
| Li H, Xu H, Yang Y L, et al. Effects of graphite and Mn ore media on electro-active bacteria enrichment and fate of antibiotic and corresponding resistance gene in up flow microbial fuel cell constructed wetland[J]. Water research, 2019, 165: 114988. | 東南大學(xué) | Water research | 11.236 |
| 能源與環(huán)境學(xué)院 | |||
| Yang Y, Liu G, Ye C, et al. Bacterial community and climate change implication affected the diversity and abundance of antibiotic resistance genes in wetlands on the Qinghai-Tibetan Plateau[J]. Journal of hazardous materials, 2019, 361: 283-293. | 中國科學(xué)院武漢植物園 | J Hazard Mater | 10.588 |
| 水生植物與流域生態(tài)學(xué)重點實驗室 |